Mutacje NHERF1 i reakcja hormonu przytarczycznego nerek ad 5

Stężenie kalcytriolu było wyższe u pacjentów z mutacjami (mediana, 53,5 pg na mililitr [zakres, 42 do 54], w porównaniu z 28,5 pg na mililitr [zakres, 15 do 39] u ośmiu pacjentów bez mutacji; P = 0,004 Test Manna-Whitneya). Przeprowadziliśmy eksperymenty in vitro w celu określenia mechanizmu, za pomocą którego te mutacje mogą zmniejszać transport fosforanu nerkowego. Ponieważ wydalanie cAMP w moczu było zwiększone u pacjentów z mutacjami NHERF1, ocenialiśmy, czy zmutowane białka NHERF1 mogą zmieniać syntezę cAMP w komórkach nerkowych w warunkach początkowych (Figura 2B) lub w odpowiedzi na PTH (Figura 2C). Transfekowaliśmy komórki nerki oposa, powszechnie stosowany model komórek proksymalnych nerkowych, które eksprymują NPT2a i PTH1R, z samym plazmidem lub plazmidem zawierającym cDNA NHERF1 typu dzikiego lub zmutowane. Wyjściowa akumulacja cAMP była podobna we wszystkich trzech rodzajach transfekowanych komórek nerkowych (Figura 2B).
Zgodnie z oczekiwaniami inkubowano komórki z syntezą cAMP stymulowaną PTH we wszystkich grupach komórkowych. Jednak akumulacja cAMP była znacznie wyższa w komórkach transfekowanych zmutowanym cDNA NHERF1 niż w tych transfekowanych cDNA typu dzikiego (Figura 2C). Skuteczność transfekcji nie uwzględnia tych różnic, ponieważ obfitość białek typu dzikiego lub zmutowanych, oceniana za pomocą metody Western blot, była podobna (patrz rysunek w dodatkowym dodatku). Ponieważ PTH1R jest sprzężony ze szlakiem fosfolipazy C, mierzyliśmy również wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia i wytwarzanie fosforanu inozytolu w odpowiedzi na PTH w komórkach nerki oposa transfekowanych cDNA typu dzikiego lub zmutowanego. W przeciwieństwie do bradykininy, która była stosowana jako kontrola, obecność PTH nie wpływała na wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia lub produkcję fosforanu inozytolu w tych komórkach.
Aby ocenić wpływ zwiększonej syntezy cAMP na wychwyt fosforanu in vitro, porównaliśmy hamujący wpływ PTH na wychwyt fosforanu w komórkach nerki oposa transfekowanych cDNA typu dzikiego lub zmutowanym cDNA NHERF1. W nieobecności PTH typ transfekowanego konstruktu nie wpływał znacząco na wychwyt fosforanu (Figura 2B). Zgodnie z oczekiwaniem dodanie PTH spowodowało znaczny spadek wychwytu fosforanu we wszystkich grupach komórkowych (Figura 2C). Jednak wpływ PTH na transport fosforanu był większy w komórkach transfekowanych zmutowanym NHERF1 niż w komórkach transfekowanych ludzkim cDNA NHERF1 typu dzikiego (Figura 2C).
Aby upewnić się, że różnice te nie wynikają z interakcji endogennego NHERF1 z transfekowanym ludzkim NHERF1, przeprowadziliśmy podobne eksperymenty w subklone (klon 2) komórek nerkowych oposa, w których ekspresja endogennego NHERF1 była niemal niewykrywalna w analizie Western blot (Figura 2D) . W tej linii komórkowej wyniki były podobne do tych opisanych powyżej: PTH zmniejszał wychwyt fosforanu we wszystkich grupach komórek (Figura 2E). Transfekcja ludzkim NHERF1 typu dzikiego, w porównaniu ze zmutowanym NHERF1, znacznie zmniejszyła indukowane przez PTH hamowanie wychwytu fosforanu. Transport fosforanu w komórkach transfekowanych zmutowanym NHERF nie różnił się znacznie od tego obserwowanego przy nieobecności NHERF1 (Figura 2E).
Dyskusja
Nasze wyniki identyfikują mutacje NHERF1 jako przyczynę utraty fosforanu nerkowego, które mogą zwiększać ryzyko powstawania kamieni nerkowych lub demineralizacji kości: mutacje zidentyfikowano tylko u pacjentów z wartościami TmP / GFR, które były poniżej normy i znacznie niższe niż u pacjentów, u których mutacje nie zostały zidentyfikowane
[patrz też: przychodnia medycyny pracy szczecin, ginekolog warszawa nfz, bewacyzumab ]